艰难困苦，玉汝于成：抗PD疗法耐药机制及克服耐药的探索（万字长文）

（原标题：艰难困苦，玉汝于成：抗PD疗法耐药机制及克服耐药的探索（万字长文））

写在最前面，本文是为了分析抗PD疗法（anti-PD-1或者anti-PD-L1等）免疫治疗的耐药机制以及客服耐药机制的探索，没有基础的或许会有些吃力，我会尽量多标注重点。本文很多内容来自Vesely MD, Zhang T, Chen L. Resistance Mechanisms to Anti-PD Cancer Immunotherapy. Annu Rev Immunol. 2022;40:45-74. doi:10.1146/annurev-immunol-070621-030155，这篇综述感兴趣的可以自己去看看，也是希望通过分享能够让大家都有所收获，同时也是想借此介绍下康方生物等国内生物医药力量在此领域的突破和贡献。

虽然癌症始于基因突变导致的细胞转化，并允许它们摆脱细胞生长限制，但大多数癌症需要远远超过癌细胞的因素来建立恶性肿瘤和转移。由癌细胞、免疫细胞和支持并促进癌症生长的基质细胞组成的另一种不规则组织被称为肿瘤微环境（Tumor microenvironment ，TME）。TME的每一个组成部分可能对肿瘤形成的潜力至关重要，因此是癌症治疗的潜在靶点。有确凿证据表明，自发的免疫反应可控制肿瘤的发展。逃避这种控制不仅是癌症的标志，也可能是TME中最有可能成功的靶向方面。因此，理解癌症中肿瘤免疫微环境（Tumor immune microenvironment, TIME）的作用对于设计和实施最佳的免疫疗法至关重要。

抗PD治疗成功的最可能原因是它靶向的是TME内局部的免疫功能失调反应，而不是通过例如细胞因子或抗CTLA-4（cytotoxic T lymphocyte–associated-4，细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4）疗法来增强全身免疫力。相比于增强全身免疫反应的免疫疗法（称为增强型癌症免疫疗法）我们更希望修复TME内局部免疫功能失调并使免疫反应恢复到正常范围的疗法（也称为正常化癌症免疫疗法），抗PD治疗是典型的正常化癌症免疫疗法。

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为什么有些患者对抗PD治疗没有反应是现代癌症治疗中的一个主要问题。一般来说，抗PD治疗的耐药性可以根据临床结果分为原发性耐药和获得性或继发性耐药，或者根据生物学机制分为先天性耐药和适应性耐药。在原发性耐药中，肿瘤从一开始就对抗PD治疗无反应。相比之下，在获得性耐药中，肿瘤最初对抗PD治疗有反应，但随后疾病进展。因此，原发性耐药通常包括先天性耐药机制，而获得性或继发性耐药包括适应性免疫耐药机制。前些年，癌症免疫治疗学会（Society for Immunotherapy of Cancer, SITC）发布了其由学术界、政府和制药及生物技术行业专家组成的多方利益相关者工作组的初步建议，以精炼抗PD治疗耐药的临床定义。SITC免疫治疗耐药工作组将抗PD治疗的耐药性定义为基于药物暴露时间和进展时间的临床参数的原发性耐药或继发性耐药。通过这种方式，继发性耐药取代了以前用于描述临床和生物学情景的获得性耐药术语。他们讨论的另一种耐药类型是在治疗因毒性而中止或停止治疗后的疾病进展。SITC建议的目的是为临床试验的入组制定明确的指南，而不是定义可能涉及原发性和继发性耐药的生物学机制。

适应性免疫耐药与原发性和继发性耐药（即临床结果）不同，它涉及肿瘤在持续的免疫攻击中使用的保护正常组织免受免疫反应有害影响的通路。这篇文章的的重点是抗PD治疗耐药的生物学机制以及TME内的功能失调免疫反应，这种反应可能出现在临床的原发性或继发性耐药中，或两者兼有。最典型的机制和适应性耐药概念的基础是在TME内B7-H1在T细胞释放IFN-γ后表达。肿瘤通过发展新的策略来适应免疫攻击。然而，重要的是要注意，相同的机制（如IFN-γ释放）可能对免疫治疗的原发性和继发性耐药性都至关重要。在这篇文章中，将专注于抗PD治疗耐药的细胞和分子过程，作为讨论耐药机制的框架，而不是将其分类为原发性、适应性或获得性。尽可能关注人类上的数据，仅在缺乏患者数据时使用临床前研究提供的机制性见解。

抗PD治疗的免疫耐药机制

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关于抗PD治疗耐药机制的大部分线索，毫不意外地，涉及免疫介导的机制。因此，我们的讨论主要集中在癌症用来躲避免疫攻击的免疫逃逸机制以及肿瘤微环境（TME）中那些使抗PD治疗效果减弱的免疫逃逸机制上。例如，传统观点认为缺乏B7-H1的肿瘤可能对抗PD治疗产生较弱反应（尤其是anti-PD-L1）此外还认为可能具有替代的免疫逃逸机制。除了这些免疫介导的耐药机制外，本文还讨论了影响抗PD治疗反应的代谢、微生物群和表观遗传学的新见解。需要注意的是，先天免疫激活和初始T细胞的刺激对于抗肿瘤免疫的形成至关重要。在T细胞受体识别肿瘤抗原后，协同刺激对于T细胞发展出细胞毒性功能并消灭癌细胞是必要的。缺乏免疫启动和初始反应可能在抗PD治疗的耐药性中发挥作用，但来自人类患者的大部分证据表明，肿瘤内或邻近淋巴结中的T细胞被激活后变得功能失调。在本文中，我们主要关注限制已激活T细胞的TME中的耐药机制。

肿瘤对免疫治疗的逃逸通常是由于适应性免疫耐药，即T细胞攻击（IFN-γ）导致TME内局部逃逸机制（B7-H1）的补偿性上调。对于表达B7-H1的肿瘤，抗PD治疗可以克服这种局部免疫功能失调。然而，在TME内还有许多其他免疫耐药机制，这些机制限制了抗PD治疗的有效性。耐药机制通常分为直接和间接两类。直接机制影响PD-1/B7-H1通路并阻碍抗PD治疗的正常工作。例子包括B7-H1表达缺失、干扰素信号通路丧失以及TME中的T细胞排斥。因此，这些直接机制也被称为目标缺失耐药。间接机制则不特定于抗PD治疗，而是癌症用来抵抗可能所有类型免疫治疗的方法，例如抗原丧失和抗原呈递缺陷。我们在此讨论了抗PD治疗中最为成熟且研究最为深入的免疫介导耐药机制的临床证。同样重要的是，由于晚期癌症的TME异质性非常的强，这里描述的许多机制并非存在于所有肿瘤中。事实上，特定机制可能在某些患者的某一时间段内发挥作用。

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肿瘤微环境中缺乏B7-H1表达

抗PD疗法的主要作用是通过特异性单克隆抗体阻断PD-1/B7-H1通路。因此，TME中缺乏B7-H1或PD-1的表达是直接的耐药机制之一。最初基于观察到黑色素瘤表现出不同的T细胞浸润和B7-H1表达模式，提出了一个以这两个参数为基础的TIME分类方案。该方案将癌症分为四种类型：I型癌症没有肿瘤浸润性T细胞或B7-H1，II型癌症既有T细胞又有B7-H1，III型癌症有T细胞但没有B7-H1，IV型癌症有B7-H1但没有T细胞。I型、III型和IV型癌症占所有癌症病例的50%以上，由于它们缺乏一个或两个关键的靶向需求，不太可能对抗PD疗法产生反应。例如，根据对非小细胞肺癌（NSCLC）累积的数据，57%的这些癌症缺乏肿瘤浸润性T细胞或肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）（45%为I型和12%为IV型）。相比之下，26%的NSCLC有TILs但缺乏B7-H1（III型），这使得只有17%的NSCLC预计会对抗PD疗法产生反应，因为它们同时存在TILs和B7-H1（II型）。这种简单的TIME分类方法解释了为什么很大一部分癌症对抗PD疗法没有反应。类似的TIME分类方法已被提出，以指导当前和未来的治疗策略，并且在几个独立研究中累积的数据表明，超过一半的癌症不表达B7-H1和/或没有浸润性T细胞，这与anti-PD疗法的较差反应有关。然而，在临床上应用这些参数来预测抗PD疗法的结果并非易事。B7-H1蛋白的检测主要依赖于肿瘤组织的临床活检，小样本量和单一时间点可能不足以代表整体情况，因为B7-H1的表达在肿瘤组织中并不均匀，通常与产生IFN-γ的TILs相邻。TME内动态的免疫反应及B7-H1的表达可能会随时间而变化。这也解释了为什么某些在肿瘤组织活检中检测到低或没有B7-H1的患者对抗PD疗法仍然有反应。除了B7-H1表达外，效应CD8+ T细胞对于抗PD疗法也至关重要。特别有趣的是，III型肿瘤中存在TILs，但缺乏B7-H1表达。这一发现表明，TME中的TILs未能产生IFN-γ，可能功能异常。当然这部分是传统观点。现在观点认为PD1高表达的T细胞可能是耗竭的象征，通过阻断PD-1+其他耗竭Marker通路如LAG-3，CD73等可以逆转T细胞耗竭，不依赖B7-H1（PD-L1）发挥功能。

T细胞缺失（被排出肿瘤微环境）

PD-1主要存在于淋巴细胞上，尤其是T细胞。如果肿瘤微环境（TME）中缺少T细胞，则会构成另一种靶点缺失的耐药机制。如上所述，超过50%的晚期人类癌症中，TME中没有显著的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）也就是冷肿瘤，这表明还存在其他因素阻碍T细胞的浸润。克服T细胞排除并增加T细胞对肿瘤的浸润是改善抗PD疗法临床效果的主要挑战。多种细胞因子如TGF-β和VEGF在TME中升高，而在临床前动物模型中，当这些因子被阻断时，T细胞的浸润增加，抗PD疗法的效果也得到了增强。临床前和临床研究已经证明肿瘤细胞和TME中的基质细胞共同参与了T细胞排除的形成。多项研究表明，有多种机制可以防止T细胞进入肿瘤，但这些途径在人体癌症患者中尚未得到测试。癌细胞中的致癌途径往往能够通过排除T细胞来促进对抗肿瘤免疫反应的逃逸。例如，磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）与肿瘤中的T细胞浸润相关；在肿瘤中表达PTEN的黑色素瘤细胞区域与更多的T细胞浸润共存。失去PTEN表达的黑色素瘤患者的临床结果较差。在一些最初对抗PD疗法有反应但随后出现疾病进展的癌症患者中，发现肿瘤在产生耐药时失去了PTEN表达。除了PTEN外，WNT-β-连环蛋白途径也与肿瘤中T细胞浸润的缺失有关。在一项研究中，一名最初对抗PD疗法有反应的黑色素瘤患者发展出了转移，并且这些转移灶表现出了新升高的β-连环蛋白表达，并且T细胞浸润消失。对33名患者的黑色素瘤细胞进行单细胞RNA测序，发现了一种与T细胞排除相关的耐药转录程序，并且该程序能够预测独立的112名黑色素瘤患者对抗PD疗法的临床反应。该耐药和排除程序在免疫疗法耐药病变中升高，表明该转录程序与抗PD疗法耐药相关。在排除T细胞的黑色素瘤中上调的基因编码了由致癌基因控制的细胞周期依赖性激酶（cyclin-dependent kinases，CDK）。与此一致的是，CDK4/6抑制剂在临床前黑色素瘤模型中增强了T细胞浸润和免疫疗法的效果。关于CDK抑制剂，国内百济神州的管线还是比较值得期待的。

干扰素信号通路的丧失

干归扰素在抗肿瘤免疫反应中起着关键作用，可能是肿瘤消除过程中最为重要的细胞因子之一。这因于其多效性功能，包括抑制肿瘤细胞增殖、增强肿瘤细胞的抗原加工和呈递能力、激活抗原呈递细胞如树突状细胞和巨噬细胞，并最终提升先天和适应性免疫效应细胞的功能，特别是增强肿瘤细胞的细胞毒性。肿瘤细胞和免疫细胞中的干扰素信号传导对于有效的抗肿瘤免疫至关重要。I型干扰素（IFN-α/β）和II型干扰素（IFN-γ）通过Janus激酶（JAK）和信号转导及转录激活因子（STAT）实现下游信号传导。尽管干扰素具有上述多种积极作用，IFN-γ也是调控肿瘤微环境（TME）中B7-H1表达的重要因子，这一调控机制包括转录和转录后水平的调节。由于B7-H1的上调能够通过与T细胞表面的PD-1结合来诱导T细胞功能失效，因此TME中的干扰素在肿瘤免疫中可能扮演双刃剑的角色。这一现象解释了肿瘤细胞如何通过适应TME来逃避免疫攻击。因此，干扰素信号通路的缺陷可能会同时削弱其正面和负面作用，从而导致对抗PD疗法的耐药性。

部分人类癌症中存在影响干扰素信号通路的突变，特别是JAK等下游信号分子的突变。例如，人类前列腺癌细胞系LNCaP缺乏JAK1的表达，导致其对干扰素不敏感。Ribas等人通过研究发现了肿瘤细胞中的B2M突变，其中两名最初对抗PD疗法（帕博利珠单抗）有反应，但后来病情进展的转移性黑色素瘤患者，其肿瘤中出现了JAK1和JAK2的功能丧失性突变。JAK2突变导致生成的细胞系中JAK2蛋白表达丧失，进而无法对IFN-γ作出反应，且无法上调B7-H1和MHC-I的表达。另一项研究在23名黑色素瘤患者和16名结肠癌患者中分别发现1例JAK1/2功能丧失突变，这些患者均接受了抗PD疗法。这些功能丧失性JAK突变的功能后果是无法对IFN-γ作出反应并调节B7-H1的表达。通过对Cancer Cell Line Encyclopedia中905个癌细胞系的分析，约0.7%的人类癌细胞系被预测具有使其对干扰素不响应的JAK1/2突变。在皮肤黑色素瘤、乳腺浸润性癌、前列腺腺癌、肺腺癌和结直肠腺癌的癌症基因组图谱（TCGA）分析中，6-12%的这些癌症中携带JAK1/2突变。此外，从转移病灶中建立的人类黑色素瘤细胞系中，一部分表现出IFN-γ信号调控基因的缺陷。在46个提交外显子测序的细胞系中，有5个（11%）具有JAK1（n=3）、JAK2（n=1）或STAT1（n=1）的突变，使得这些细胞对T细胞介导的杀伤作用不敏感。尽管JAK1/2突变被预测会导致功能丧失并降低对干扰素的响应，与较差的生存率相关，但这些突变对患者生存率的影响尚不完全明确。需要进一步研究以确定干扰素信号通路的丧失在抗PD疗法耐药中的普遍性，并探讨是否有可能实施干预措施来克服这一缺陷。

免疫编辑导致的抗原丢失

免疫系统在消除肿瘤细胞和促进肿瘤生长中的双重作用通常被称为癌症免疫编辑。肿瘤微环境（TME）中免疫细胞、肿瘤细胞和基质细胞的网络会导致肿瘤的三种可能结果之一：消除、平衡或逃逸。在临床前模型中，T细胞介导的肿瘤特异性抗原（如新抗原）识别对肿瘤细胞的清除至关重要，这也可能影响抗PD疗法的反应。新抗原的识别有时被称为癌症免疫治疗的最终共同通路，因为多种不同类型的免疫疗法，包括抗PD疗法，都需要识别并随后破坏肿瘤细胞。较高的肿瘤突变负荷被认为可以产生更多的新抗原，并且在一些研究中与更多的肿瘤浸润T细胞、更高的T细胞受体（TCR）多样性以及T细胞导向的免疫疗法的改善预后相关。

在人类癌症中，预测的新抗原负荷与生存率和抗PD疗法的反应呈正相关。效应CD4+或CD8+ T细胞对这些新抗原的识别也已得到证实。值得注意的是，抗PD疗法可以增强T细胞对新抗原的反应性。在一名黑色素瘤患者中，肿瘤内的新抗原特异性T细胞动态研究表明，肿瘤细胞新抗原的表达可以随着时间的推移而丧失，这与癌症免疫编辑过程一致通过主动的抗肿瘤免疫反应进行的免疫选择可能导致新抗原丧失变异体的出现，并引发肿瘤免疫逃逸。这种通过新抗原丧失引发的免疫逃逸机制可以在未经治疗的癌症早期阶段发生，显示出免疫系统强大的选择压力。新抗原图谱的这一演化过程也可以在抗PD治疗期间发生，导致治疗耐药性。在一项非小细胞肺癌（NSCLC）的研究中，研究者对治疗前和治疗后来自抗PD治疗耐药患者的配对活检样本进行了全外显子组测序和TCR克隆测序，分析了新抗原的变化。在42名NSCLC患者中，有4名被发现通过新抗原的丧失而对抗PD治疗产生了耐药性，而不是由于抗原加工和呈递机制的缺陷。预测的新抗原肽被测序，并被患者自身的T细胞识别，表明在抗PD治疗之前，患者体内已经存在对新抗原的内源性T细胞反应，但在抗PD治疗后通过癌症免疫编辑过程，这些新抗原被丧失。在另一项对88名早期未治疗的NSCLC患者的研究中，43名患者中检测到通过拷贝数丧失引发的新抗原减少。在TRACERx RNA-seq中，研究者发现28名NSCLC患者中存在通过启动子高甲基化导致的新抗原沉默，这是一种表观遗传的免疫编辑机制。

肿瘤抗原呈递的缺陷

肿瘤细胞可能在抗原加工和呈递机制上存在缺陷，阻碍免疫系统识别癌细胞中的新抗原。尽管这种机制在预临床模型中的实验条件下被广泛证明，但在实际抗PD治疗中，尚难以确定这种现象的发生频率。已有研究发现，MHC-I在癌症中出现突变。McGranahan等人使用一种计算工具鉴定人类白细胞抗原（HLA）的杂合性丧失，发现40%的非小细胞肺癌（NSCLC）通过杂合性丧失出现HLA丧失，导致新抗原结合丧失并引发免疫逃逸。在一项未接受治疗的NSCLC患者的研究中，56%的肺腺癌和78%的肺鳞癌患者表现出HLA杂合性丧失。目前尚不清楚这种HLA杂合性丧失是否会在抗PD治疗过程中阻止肿瘤抗原的呈递。

一项近期研究发现，一位初期对抗PD疗法（pembrolizumab）有反应的转移性黑色素瘤患者，在治疗后期出现了病情进展。通过纵向活检获取的肿瘤细胞外显子组测序结果表明，患者在治疗前后都携带β2-微球蛋白（β2m）基因（B2M）的截断突变。这种突变导致B2M缺失，而B2M对HLA-I类分子的稳定性至关重要。因此，MHC-I可能不稳定，无法向肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）呈递新抗原。Gettinger等人分析了14例对抗PD治疗产生耐药的肺癌，其中1例肿瘤出现B2M的纯合性丧失，导致HLA-I类分子无法在细胞表面表达，另外两例则表现出B2M的下调。另一项针对转移性黑色素瘤的研究对17位在免疫治疗后出现进展的患者进行了纵向肿瘤活检。在这些患者中，有5例（29.4%）肿瘤显示出B2M的缺陷。相比之下，在对免疫治疗有反应的患者中未检测到B2M的改变。抗PD治疗的一个显著特点是，它是第一个根据分子特征而非特定癌症类型批准的癌症疗法。在功能丧失的错配修复通路的癌症中，抗PD治疗可以有效控制免疫反应。两位患有错配修复缺陷型肿瘤并对抗PD治疗产生耐药的患者被发现具有B2M突变。

总的来说，独立队列的研究表明，抗原呈递的缺陷既可能发生在治疗前，也可能发生在治疗过程中。尽管这些不同癌症类型中的显著案例已被报道，但这种机制的普遍性仍然不清楚。这可能与肿瘤样本采集有关，并强调了在患者接受免疫治疗期间对肿瘤进行纵向活检的必要性。此外，B2M在全身组织中广泛表达，健康人和癌症患者的血清中都可以检测到高水平的可溶性B2M蛋白。理论上，这种可溶性B2M蛋白可能通过稳定HLA来补偿肿瘤细胞中B2M的缺失。因此，目前尚不确定B2M的缺失是否必然导致肿瘤抗原呈递的丧失。

免疫抑制细胞

免疫抑制细胞如调节性T细胞（Tregs）、髓源性抑制细胞（MDSCs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）在预临床癌症模型中会削弱抗肿瘤免疫反应。研究表明，Tregs在多种癌症类型的肿瘤微环境（TME）中浸润，并对临床结果产生负面影响。抗CTLA-4疗法调节免疫反应的部分作用可能与其对Tregs的靶向有关。然而，目前关于Tregs如何影响抗PD治疗反应的研究还相对有限。虽然已有研究观察到Tregs变化与抗PD治疗反应之间的相关性，但TME中的具体变化尚未深入探讨。这可能是因为抗PD治疗的反应主要发生在TME内，而不是外周淋巴器官。

MDSCs是一类被招募到TME中并具有免疫抑制功能的异质性髓系细胞。早期研究表明，MDSCs是负性预后因素，但近期涉及多种癌症类型的数据尚未得出一致结论。这可能与不同细胞亚群的分析相关：循环中的MDSCs与肿瘤浸润的MDSCs功能可能不同。此外，不同亚群的MDSCs对生存率的影响也可能存在差异。多项预临床研究显示，靶向MDSCs能够增强免疫治疗效果，包括抗PD治疗，目前的临床试验正在探索这种组合疗法。这些针对人类患者的研究将有助于确定MDSCs是否是临床抗PD治疗耐药的关键介质。

肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是另一类被吸引到TME中的抑制性髓系细胞，其免疫抑制机制与MDSCs类似。TAMs已被证明是影响患者预后的重要因素之一，靶向这些细胞已成为临床研究的热点领域。例如，TREM2在肿瘤浸润巨噬细胞中表达，预临床研究中发现其促进了抗PD治疗过程中肿瘤的生长，并且TREM2的表达与人类癌症的不良预后相关。对TME中髓系细胞的重新编程在预临床模型中有效改善了免疫治疗耐药性，为人类癌症中靶向髓系细胞奠定了基础。然而，目前尚难预测靶向抑制性髓系细胞是否能够成功克服人类癌症患者的抗PD治疗耐药性。近期的研究显示，靶向由抑制性髓系细胞表达的免疫抑制分子吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO1）在与抗PD治疗联合使用时，并未为黑色素瘤患者带来额外益处。这些免疫抑制细胞可能具有重要的预后价值，因为它们反映了TME中正在进行的活跃免疫逃逸机制，但目前尚无足够的治疗数据表明这些细胞是抗PD治疗耐药的关键机制。未来的研究可能通过识别并靶向特定的髓系细胞亚群或由髓系细胞表达的特定抑制分子，最终增强抗PD治疗的疗效，从而广泛抵消其在癌症患者中的抑制作用。

肿瘤微环境中的共抑制分子

在肿瘤微环境（TME）中，共抑制分子的表达是肿瘤免疫逃逸的根本机制之一。效应T细胞通过抑制性受体-配体的相互作用受到抑制，导致功能障碍。成功靶向PD-1/B7-H1共抑制轴证明了阻断局部功能障碍T细胞的强大方法，从而实现T细胞的再活化，进而消除或控制肿瘤。在过去十年中，多个免疫共抑制通路被发现，并在临床前模型中用于癌症免疫治疗。在此，我们讨论可能导致癌症患者对抗PD治疗产生耐药性的共抑制分子。

淋巴细胞活化基因3蛋白（LAG-3）在T细胞上表达，并在与其经典配体MHC-II结合时向T细胞传递共抑制信号。在TME中，功能障碍的T细胞表达更高水平的LAG-3，且几种阻断性抗体正在癌症免疫治疗领域进行临床开发。Gettinger等人对抗PD治疗耐药的非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤进行了免疫治疗前后的活检，发现治疗后8例肿瘤中的5例肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）上LAG-3的表达增加。此外，8例中有3例显示T 淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3（TIM-3）表达增加。同时，其他免疫抑制分子如T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白（TIGIT）的上调也被观察到，但这些变化未达到统计显著性。这表明在某些抗PD治疗耐药的患者中，LAG-3的表达有补偿性增加，TIM-3的表达增加则较为次要。另一项研究表明，两名在抗PD治疗中出现耐药的患者的肿瘤浸润T细胞上出现TIM-3上调，但未出现LAG-3上调。由于样本量较小，难以得出明确结论，无法确认LAG-3或TIM-3的上调是否是抗PD治疗耐药的直接原因。此外，该研究队列中的一些耐药肿瘤在抗PD治疗后抑制受体的表达有所下降，提示可能存在其他逃逸机制。最近的研究通过识别纤维蛋白原样1蛋白（FGL-1）为LAG-3的主要共抑制配体，揭示了靶向LAG-3通路的新前景。FGL-1是一种可溶性蛋白，通常由肝脏低水平分泌，但在许多实体肿瘤中其表达高度上调。这些配体对LAG-3介导的共抑制作用的相对贡献尚不明确，尚不清楚是否需要阻断一种或两种配体以最大化治疗效果。有趣的是，FGL-1与LAG-3上的一个与MHC-II不同的分子口袋结合，这意味着以前开发的靶向LAG-3的单克隆抗体可能需要重新评估，以确保对LAG-3共抑制信号的完全阻断。

另一个可能与耐药性有关的共抑制分子是程序性死亡1同源物（PD-1H），或称V结构域免疫球蛋白T细胞活化抑制因子（VISTA），其属于CD28家族。与PD-1、CTLA-4和LAG-3不同，PD-1H在多种免疫细胞（包括T细胞和髓样细胞亚群）中表达。最近的一项研究表明，其与P-选择素糖蛋白配体1（PSGL-1）相互作用，在酸性环境中向T细胞传递共抑制信号，暗示该相互作用在TME中具有重要作用。在临床前模型中阻断PD-1H对抗癌症有效，且相关单克隆抗体正在进行癌症免疫治疗的临床开发。在一项对抗PD治疗耐药的黑色素瘤患者的研究中，对10对匹配的治疗前和疾病进展期活检样本进行了VISTA表达分析。在10例中，有7例（70%）发现VISTA表达增加，这表明VISTA可能是抗PD治疗耐药的机制之一。

除了在抗PD治疗中上调的共抑制分子外，某些肿瘤可能不表达B7-H1，而是通过其他抑制途径来逃逸治疗。缺乏B7-H1的肿瘤对抗PD治疗的反应较差，并且可能存在类似上述I型和III型TIME肿瘤的缺失靶标耐药性。III型TIME肿瘤缺乏B7-H1，但浸润有T细胞，这些T细胞很可能由于其他抑制途径而失去功能。一种最近描述的新型共抑制分子Siglec-15在多种主要缺乏B7-H1的癌症类型中表达。Siglec-15在肿瘤浸润的髓样细胞上表达，阻断Siglec-15可以促进抗肿瘤免疫反应。另一项研究验证了Siglec-15的表达在不同肿瘤类型中的差异，且与肺腺癌的较差预后相关。I期临床试验显示了良好的安全性和在肺癌、头颈癌及三阴性乳腺癌中的令人鼓舞的临床反应，目前II期临床试验正在测试抗Siglec-15单克隆抗体在晚期癌症治疗中的有效性。

分泌性免疫抑制因子

肿瘤微环境（TME）的免疫抑制一部分是通过肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞分泌的各种因子来实现的，这些因子限制了抗肿瘤免疫。多种细胞因子和分泌性免疫抑制因子，包括IL-8，已在临床前模型和某些人类癌症中被发现抑制抗肿瘤免疫反应。最近，研究发现一种由黑色素瘤分泌的因子能够促进免疫逃逸，并提示患者预后不良以及对抗PD治疗产生耐药性。Midkine由黑色素瘤细胞分泌，具有高Midkine表达特征的肿瘤通常富含肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和调节性T细胞（Tregs），且与不良预后密切相关。在一项黑色素瘤患者队列中，Midkine表达较高的患者对抗PD治疗的反应较差。此外，肿瘤细胞还分泌诸如转化生长因子β（TGF-β）等细胞因子，该细胞因子在TME中对多种细胞具有广泛的作用TGF-β信号通路活跃的癌症分子分类通常与预后不良以及抗PD治疗反应不佳相关，尤其是在癌症相关成纤维细胞中。TGF-β在基质细胞中的信号传导也与T细胞浸润减少相关，并可能促进T细胞的排除。目前，多个靶向TGF-β与抗PD治疗联合的临床试验正在进行中，但尚未有结果发布。

另一种在TME中分泌的免疫抑制分子是腺苷，其通过多种机制在局部发挥抑制作用。腺苷能通路活跃与人类癌症预后不良相关，靶向该通路的研究在临床前模型中显示出潜力。目前，针对癌症患者的抗PD治疗联合靶向腺苷的临床试验正在进。与腺苷类似，IDO1是一种在TME中水平升高的小分子，具有广泛的作用并抑制抗肿瘤免疫。然而，IDO1与PD-1的双重阻断在黑色素瘤患者中未显示出额外的临床获益。目前，关于分泌性免疫抑制因子在癌症患者中是否确切介导了抗PD治疗耐药性，还缺乏足够的证据。靶向CD73等酶类ICI或许可以实现对此类免疫抑制分子的产生的抑制。如康方生物的抗CD73的单抗和多款双抗。

图片来源：Vesely MD, Zhang T, Chen L. Resistance Mechanisms to Anti-PD Cancer Immunotherapy. Annu Rev Immunol. 2022;40:45-74. doi:10.1146/annurev-immunol-070621-030155

代谢与抗PD治疗耐药

近一个世纪前，奥托·瓦尔堡发现了癌细胞与正常细胞相比有着独特的代谢方式。如今，我们知道，不仅是癌细胞的代谢，免疫细胞的代谢也对癌症的进展和转移起到了推动作用。然而，关于代谢在抗PD治疗耐药中的角色，人类研究知之甚少。大部分关于癌细胞代谢和免疫代谢在抗肿瘤免疫反应中重要性的证据来源于临床前研究。癌细胞代谢如何通过营养竞争、缺氧、酸性环境以及免疫调节代谢物来促进免疫抑制性肿瘤微环境（TME）已在一些文献中进行了详细综述。本文将简要讨论在临床前癌症模型中，抗PD治疗引发的代谢重编程证据，以及代谢可能作为抗PD治疗耐药机制的新兴证据。

细胞代谢调控着T细胞的基本功能，例如T细胞的共刺激、T细胞激活、通过有氧糖酵解产生IFN-γ，以及通过线粒体融合决定记忆T细胞的命运。多项研究表明，代谢重编程可以增强抗肿瘤免疫反应，并提高抗PD治疗效果。在TME中，肿瘤细胞和T细胞争夺资源，这种代谢竞争可能促进癌症进展。在一项研究中，抗PD治疗使T细胞恢复了糖酵解能力和效应功能，从而消灭了已建立的癌症，这表明TME中的T细胞低反应性可能是由代谢限制引起的。此外，研究意外发现B7-H1可以调控肿瘤细胞的糖酵解代谢，开启了另一个研究方向，即抗PD治疗是否影响癌细胞代谢。

随着技术手段和算法的进步，人类癌症代谢图谱的研究变得更加深入（。创新的单细胞技术用于剖析人类结直肠癌中T细胞的代谢表型，发现肿瘤内部扩增的T细胞与肿瘤免疫边界的排除型T细胞在代谢上存在显著差异。最近的一项研究发现，前列腺羟化酶-3的缺失与来自TCGA数据库中的人类癌症中CD8+ T细胞功能下降相关。

几项临床前模型研究表明，异常的脂质代谢可能在抗PD治疗耐药中起到重要作用。胆固醇对T细胞增殖和活化至关重要，因为它调控TCR聚集和脂筏。抑制胆固醇酯化酶ACAT1可以增强CD8+ T细胞功能，并在小鼠肿瘤模型中改善抗PD治疗效果。此外，Ma等人发现TILs进入TME后摄取胆固醇，导致共抑制分子PD-1、LAG-3和TIM-3上调，并在临床前肿瘤模型中表现出耗竭表型。T细胞中胆固醇的增加还可能通过上调CD36导致功能丧失，进而诱发脂质过氧化和铁死亡。最近的研究表明，CD8+ T细胞的甲硫氨酸代谢可能受损，导致STAT5表达下降，T细胞免疫力受损。这项研究还显示，甲硫氨酸转运蛋白SLC43A2在TCGA数据库中癌症组织中的表达比匹配的正常组织高，并与这些癌症中的CD8和IFNG转录本呈负相关。在黑色素瘤患者中，高SLC43A转录水平的浸润性T细胞显示效应基因的低表达，并通过组蛋白修饰与T细胞免疫反应下降相关。因此，异常代谢可能导致TME中T细胞功能障碍的表观遗传改变。

尽管这些研究非常有前景，但目前尚无直接证据表明代谢通路能够在人类中区分抗PD治疗的应答者和非应答者。因此，我们无法明确指出代谢是抗PD治疗耐药的机制。未来的研究可能会改变这一现状。目前尚不清楚在人类患者中靶向代谢通路是否能改善T细胞功能并促进抗肿瘤免疫反应，因为这些仅在临床前模型中得到了验证。实际上，靶向IDO1的最有前景的代谢疗法在III期临床试验中失败了，即使与抗PD治疗联合使用也未能取得成功，尽管其在临床前和I/II期临床试验中表现出良好前景。目前，针对其他代谢靶点的疗法正在临床试验中。或许，未来更有力的证据将来自肠道微生物组，因为那里的微生物代谢物可能会调节抗肿瘤免疫反应。

微生物群

微生物群在免疫系统的发育、教育以及疾病的发病机制中起着重要作用。如今，肠道微生物群对癌症免疫疗法的应答产生影响这一观点已经得到认可。这一见解最初是在癌症的临床前模型中得出的，实验表明具有不同肠道微生物群的小鼠对抗PD治疗或抗CTLA-4治疗的反应不同。在人类癌症患者中，抗PD治疗和/或抗CTLA-4治疗改变了肠道微生物群。随后，2018年的三项研究表明，人类癌症患者可以根据其肠道微生物群的差异分为抗PD治疗的应答者和非应答者。对接受抗PD治疗的43名黑色素瘤患者的粪便微生物群样本进行分析后，发现应答者（30例）和非应答者（13例）之间的微生物群组成存在差异。另一项针对42名黑色素瘤患者的研究中，发现不同的粪便微生物群构成与抗PD治疗的应答者（16例）和非应答者（26例）相关。有趣的是，这些黑色素瘤队列中与抗PD治疗应答相关的特定细菌物种有所不同，这表明即使在同一种癌症亚型患者中，也没有普遍的与应答相关的细菌物种。Routy等人证明，肠道微生物群的组成也与非小细胞肺癌、肾细胞癌和尿路上皮癌患者对抗PD治疗的应答相关。此外，免疫治疗期间的抗生素暴露会对抗PD治疗的应答产生负面影响。令人感兴趣的是，这些研究表明，从应答者中移植的粪便微生物群能够增强抗PD治疗的疗效，表现为在无菌小鼠的TME中CD8+ T细胞密度增加和Tregs减少。这些研究和其他研究进一步确立了肠道微生物群作为抗PD治疗初级耐药生物标志物的潜力，以及抗生素对接受抗PD治疗患者可能产生的负面影响。然而，我们尚不清楚导致这些关联的机制，也不知道微生物群的改变是否会促成抗PD治疗的继发性耐药。目前，专门操控癌症患者肠道微生物群的临床试验正在进行中，期待这些研究能够阐明微生物群对癌症免疫应答的影响。在最近的两项I期临床试验中，25名对抗PD治疗产生耐药的黑色素瘤患者在重新接受抗PD治疗前进行了粪便微生物群移植，结果表明通过调控肠道微生物群进行免疫治疗是可行且有效的两项研究均使用了来自抗PD治疗应答患者的肠道微生物群。在一项包含10名患者的研究中，3名患者的肿瘤负担减少，CD8+肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）增加。在另一项包含15名黑色素瘤患者的研究中，6名患者对粪便微生物群移植和抗PD治疗产生了应答。应答者的肠道微生物群发生了持久的变化，CD8+ T细胞活性增加，IL-8表达的髓系细胞减少。使用益生菌来缓解接受抗生素治疗患者的肠道菌群失调可能是有益的。虽然我们尚不清楚具体哪些细菌种群与抗PD治疗应答之间的关联，但一些临床前模型表明，微生物代谢产物可能通过增加T细胞的IFN-γ产生来发挥作用。其他机制也被提出，例如细菌从肠道转移至TME、癌症抗原与微生物肽之间的交叉反应，以及癌细胞直接呈递细菌肽。这些提出的机制表明，通过先天免疫激活、淋巴细胞授权或T细胞刺激来增强抗肿瘤免疫反应也在克服抗PD治疗耐药中起着重要作用。需要在人类癌症患者中进行更多研究，以确定微生物群是否在耐药机制中发挥关键作用，如果是，该如何靶向这一耐药机制。

表观遗传学与抗PD治疗耐药

与代谢一样，基因表达的修饰，表观遗传调控，是癌细胞和免疫细胞中至关重要的基本细胞过程。基因表达的调控通过表观遗传修饰因子实现，包括组蛋白去乙酰化酶、组蛋白甲基转移酶、DNA甲基转移酶等。表观遗传修饰驱动T细胞分化和功能，从而对抗肿瘤免疫反应产生重要影响。因此，表观遗传修饰与癌症免疫治疗有关并不令人惊讶。选择性表观遗传修饰因子的表达与癌症预后相关，表观遗传修饰可以增强小鼠的免疫治疗效果。此外，由于表观遗传的稳定性，功能失调的T细胞可能对抗PD治疗产生耐药。基于临床前研究，旨在通过表观遗传修饰来增强免疫治疗应答的临床试验正在进行中，这些方法包括组蛋白去乙酰化酶、组蛋白甲基转移酶和DNA甲基转移酶的抑制剂。然而，目前尚不清楚联合抗PD治疗靶向这一基本细胞过程是否对癌症患者有益。例如，组蛋白甲基转移酶Ezh2的阻断可以增加T细胞应答，也可能降低T细胞对癌症的应答，这可能是由于对T细胞亚群的差异性影响。除了Ezh2对T细胞的多效性作用外，Ezh2的抑制还被证明会削弱树突状细胞（DCs）的功能。目前没有足够的临床证据支持全球表观遗传修饰作为抗PD治疗耐药的机制。然而，选择性的表观遗传修饰可能对抗PD治疗的免疫耐药机制起到了贡献。例如，非小细胞肺癌（NSCLC）患者中已证明通过启动子高甲基化导致新抗原的丧失。此外，参与抗原呈递（如β2微球蛋白，β2m）和干扰素信号传导的蛋白质丧失，以及驱动抗PD治疗耐药的抑制性免疫受体的表达增加，可能也是通过表观遗传途径调控的。最后，表观遗传修饰负责维持T细胞的功能失调或耗竭状态，从而限制了对抗PD治疗的应答。

克服抗PD治疗的耐药

克服抗PD治疗的耐药是当前癌症免疫治疗和肿瘤学领域面临的主要挑战之一。然而，这一努力应以理解耐药背后的机制为指导，采取科学驱动的方法，而不是将现有药物和疗法随意组合。尽管我们在克服抗PD治疗耐药的过程中仍在不断努力，且对其理解还不够完善，但一些基本原则正在显现，并可用于指导癌症的治疗。

显而易见，抗PD治疗主要靶向的是肿瘤微环境（TME）。为了更好地定义TME中的动态变化及其细微差别，仍需开展更多研究。因此，获取组织样本对于研究耐药机制至关重要。只有在治疗前后进行的纵向活检，才能区分应答者与非应答者的TME免疫背景差异。需要新的工具来探究TME中不断演变的免疫反应。最近，单细胞技术的进步帮助鉴定了与抗PD治疗应答相关的关键免疫细胞。但大多数研究仅关注从肿瘤中分离出来并置于悬浮状态的少数细胞群体，忽略了TME的复杂结构。新一代组织学技术允许进行单细胞空间蛋白质组学分析，包括成像质谱细胞计数技、多重离子束成像和索引共检测技术（CODEX），这些技术为TME内部的异质性提供了前所未有的空间分辨率。通过基于组织学的转录组平台，如数字空间分析和空间转录组学，基因表达的空间分辨率也揭示了癌症复杂的肿瘤-免疫界面的新见。这些新工具可能有助于发现与抗PD治疗应答相关的新生物标志物以及耐药机制。此外，利用单细胞空间分辨率观察TME可能使我们能够检测到同一肿瘤中同时发生的多种耐药机制，这些机制在微区域中具有时间和空间的分离性。

预测性和预后性生物标志物

自免疫生物标志物与癌症预后相关性被发现以来，包括T细胞浸润和B7-H1表达，多个标志物已被鉴定。随着单细胞技术和计算生物学的进步，新的生物标志物逐渐出现，帮助根据患者对抗PD治疗的应答进行分类，提供了重要的预后见解。尽管肿瘤突变负荷最初被确立为预后性生物标志物，并可预测抗PD治疗的应答，但后续研究对肿瘤突变负荷作为抗PD治疗应答标志物的实用性提出了质疑。不同癌症类型之间以及同一种癌症内部TME的异质性，是识别具有临床实用性的抗PD治疗应答生物标志物面临的挑战之一。鉴于免疫逃逸机制的复杂性，需要识别多个生物标志物，以便选择最合适的免疫疗法，单独使用或与抗PD治疗联合使用。关于这一点我之前也写过一篇文章“使用Anti-PD-1抗体，PD-L1是完美Marker吗？” 网页链接，有过一定的阐述，感兴趣的可以去看看。

联合疗法

克服抗PD治疗耐药的一个关键方法是与其他药物靶点联合使用，以增强抗肿瘤反应。抗CTLA-4疗法是最成功的联合疗法之一，它是转移性黑色素瘤的标准治疗方案，并且在其他癌症中也显示出疗效，尽管伴随着更大的毒性。CTLA-4和PD-1的双重阻断提高了黑色素瘤患者的五年总体生存率。抗CTLA-4联合疗法的主要缺点之一是严重的全身毒性，这可能解释了为什么使用这种组合的临床试验数量在下降，而总体上的联合试验却在增加。全球正在测试数百种与抗PD治疗联合使用的独特药物组合。在2020年抗PD治疗临床试验的分析中，在3,674项正在进行的抗PD治疗试验中，2,949项（80%）为联合治疗试验。抗PD治疗与253种不同的药物靶点组合进行联合，包括免疫肿瘤疗法（如CTLA-4、溶瘤病毒、癌症疫苗、其他免疫抑制分子）、靶向疗法（如VEGF）、化疗和放疗。抗PD治疗临床试验的快速增长，特别是联合试验，可能不会在短期内放缓，尽管全球新冠肺炎大流行，这一趋势仍在继续。一些联合治疗策略直接向肿瘤中注入免疫刺激分子。我们预测，不幸的是，许多甚至大多数此类联合临床试验将以失败告终。原因在于，要克服TME中的免疫逃逸机制和抗PD治疗耐药，并优化抗肿瘤免疫反应，必须有针对性地调控局部免疫功能障碍。抗PD治疗的成功表明，这一经验教训至关重要。靶向TME中局部失调的免疫反应的方法被称为正常化癌症免疫治疗。各种联用疗法中往往会因为副作用大而导致过多患者停药，或是不够阳性的OS数据，这就为康方生物等低毒高效的双抗如AK104、AK112等的使用留下了空间。具体也可以参考我的另一篇文章“为什么是康方生物的双抗？免疫治疗：从单靶点单抗到联合治疗再到双抗” 网页链接，康方生物的双抗可以很好的控制副作用。

正常化癌症免疫治疗

如上所述，抗PD治疗是典型的正常化癌症免疫治疗。肿瘤使用的多种免疫逃逸机制表明，在TME中存在其他关键的调控因子，因此迫切需要识别并靶向这些机制。开发正常化癌症免疫治疗有三个指导原则。首先，识别发生在TME中的局部肿瘤免疫逃逸机制，这与适应性免疫耐药类似。其次，选择性地靶向TME中的免疫功能障碍可以限制全身毒性。最后，成功靶向局部免疫逃逸机制应当能够将功能失调的免疫反应重编程为正常的抗肿瘤免疫反应，消灭癌细胞，并促进组织稳态。尽管抗PD治疗比其他免疫疗法更符合正常化癌症免疫治疗的这些原则，但仍不完全符合。接受抗PD治疗的患者可能会经历全身毒性，且癌细胞可能无法完全清除。尽管如此，正常化癌症免疫治疗的原则应成为未来疗法和合理临床试验设计的理想框架。

结论

总结一下，尽管已知PD-1抑制了下游TCR信号通路，但抗PD治疗的确切有效机制仍大部分未知。对TME响应抗PD治疗的单细胞分析已经鉴定出了一些可能参与癌症根除的关键机制。随着对最直接响应抗PD治疗的关键T细胞亚群以及树突状细胞或巨噬细胞亚群的识别，组织稳态如何恢复或正常化仍不清楚。在很多方面，我们对抗PD治疗为何未能根除癌症的了解多于其如何导致长期癌症缓解的了解。许多抗PD治疗的耐药机制是相互关联且动态的，因此难以理清。虽然试图将抗PD治疗的耐药机制划分为免疫、微生物群、代谢和表观遗传等离散类别，以便于理解，但耐药通常涉及其中多个类别，复杂程度令人困惑。未来的研究肯定会发现本文未讨论的额外耐药机制，新的免疫治疗挑战也需要解决。许多问题仍然存在：在单个患者甚至同一患者的单个转移病灶中，有多少种抗PD治疗机制在同时发挥作用？克服特定耐药机制的策略可以实施的时间窗口是什么？我们能否在开始治疗之前识别耐药机制？除了抗PD治疗之外，免疫治疗的其他独特耐药机制也需要探讨，以便制定预防或治疗这些机制的策略并改善临床结果。尽管如此，抗PD治疗靶向TME的变革性成功继续为我们带来希望与乐观，相信医学界、学术界和工业界将共同合作，克服这些挑战。

那么也是希望中国能够多一些康方生物，百济神州，信达生物这样的在免疫治疗以及联合治疗抗实体瘤领域的尝试，尤其是康方生物的多种途径的探索，不管是AK104和AK112这样的已经比较成熟开始获批临床的双抗，还是AK117等在推进三期临床的比较新的免疫检查点的药物，又或是康方生物更新的PD-1/CD-73双抗、PD-1/LAG-3双抗、CD73/LAG-3双抗等确实很有魄力和眼光。也希望多一些成功的治疗方案，能够让患者有更多更精确更有效更低副作用的选择。本文仅作学术分享和自我记录，不构成投资建议。本文部分内容出自Vesely MD, Zhang T, Chen L. Resistance Mechanisms to Anti-PD Cancer Immunotherapy. Annu Rev Immunol. 2022;40:45-74. doi:10.1146/annurev-immunol-070621-030155，如有侵权请联系删除。风险提示：本文所提到的观点仅代表个人的意见，所涉及标的不作推荐，据此买卖，风险自负。谢谢大家了。$康方生物(09926)$ @雪球创作者中心 #雪球星计划#

补充分析：按照四种类型：I型癌症没有肿瘤浸润性T细胞或B7-H1，II型癌症既有T细胞又有B7-H1，III型癌症有T细胞但没有B7-H1，IV型癌症有B7-H1但没有T细胞。I型、III型和IV型癌症占所有癌症病例的50%以上，由于它们缺乏一个或两个关键的靶向需求，不太可能对抗PD疗法产生反应。例如，根据对非小细胞肺癌（NSCLC）累积的数据，57%的这些癌症缺乏肿瘤浸润性T细胞或肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）（45%为I型和12%为IV型）。相比之下，26%的NSCLC有TILs但缺乏B7-H1（III型），这使得只有17%的NSCLC预计会对抗PD疗法产生反应，因为它们同时存在TILs和B7-H1（II型）。这种简单的TIME分类方法解释了为什么很大一部分癌症对抗PD疗法没有反应。目前不管是K药或者其他PD-1/PD-L1单抗，收益最大的都是既有T细胞又有B7-H1的II型癌症，但是在NSCLC中只占17%，而像康方生物这样的多ICI双抗的设计，如康方生物的AK104（PD-1/CTLA-4双抗），AK137（CD73/LAG-3双抗）等首先就能使有TILs但缺乏B7-H1（III型）中的很多获益，而这一部分在NSCLC中占比为26%，仅靠这一部分康方生物的受众就有可能会接近翻倍。其次康方生物AK112（PD-1/VEGF双抗）等药物还有能改善肿瘤微环境T细胞浸润的功能，对于NSCLC中12%为IV型的患者也有可能有大量的受益者。至于45%的I型NSCLC，康方生物的多款改善TME的药物联用也提供了免疫疗法获益的可能性。所以说康方生物的双抗药物绝不是简单的和K药抢市场竞争那么简单，而是提出了免疫治疗更多的可能性。